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| 经济林木基因转化技术 刘占德(陕西省农科院信息所) |
基因转化技术是利用基因工程方法改良植物性状最基本的手段和途径。目前经济林木常见的转化方法有农杆菌介导法（agrolbacterium-mediated）、生物弹射击法（biolistic system）和DNA直接摄取法（direct DNA uptake）等。
1、农杆菌介导基因转化
目前已探讨的各种基因转化方法中，农杆菌介导转化是研究最清楚的一种。10余种经济林木基因转化研究取得成功，其大多数采用农杆菌介导转化法。这是因为：①农杆菌侵染的主要对象是双子叶植物；②由Horsch建立叶盘法农杆菌介导培养转化体系以来，农杆菌介导的遗传转化基因无需以原生体作为目的基因的受体而使其操作简便易行，从而得到广泛应用。
这种方法是利用农杆菌［包括根癌农杆菌（agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（A.rhizogines）」作为中间介体，受伤的植物细胞被农杆菌感染后，农杆菌携带的质粒DNA片段称为转移DNA（Transfer DNA，T-DNA），会插入到寄主细胞的核基因组中，从而实现基因转化。Fralely-R．T等首先在烟草上利用农杆菌介导技术成功地获得了转基因植株，随后这种方法迅速在多种植物上得到了广泛的应用。农杆菌的主要侵染对象是双子叶植物，单子叶植物对农杆菌一般不太敏感，但最近也有不少感染致病的报导。绝大多数经济林木对农杆菌比较敏感，因此农杆菌介导技术便成为经济林木基因转化的主要手段。Mcgranahan-GH等用核桃无性胚接种带有PCGN200′594质粒的农杆菌，得到了第一个来自无性胚的转基因植株；Scorza-R等用带有复合质粒的农杆菌6044接种桃叶片和胚愈伤组织，得到了转基因植株；Mante-S等用李的下胚轴切片，接种带有PCGH7001或PCGH7314质粒的农杆菌，得到了转基因李植株；新西兰从一种小果实的红肉猕猴桃中分离，提取出控制红肉的基因，然后用农杆菌介导法转移到大果猕猴桃品种中，现已得到一个果重70g以上的红肉猕猴桃，这是世界上第一个有实用价值的转基因经济林木。除此之外，目前利用该方法还在苹果、葡萄、扁桃、杏、树莓、黑茶子、美洲山核桃、柑桔、芒果、杂交山杨、桉树、日本柿、番木瓜、橡胶树等经济林木中获得转基因植株。
应用农杆菌介导法的前提条件为：①具有对转化植物敏感的去除致癌区DNA（T-DNA）并携带外源基因的农杆菌工程菌种；②具有方便可行的筛选转化细胞的选择标记基因；③理想的植物受体材料。为此，近年来基因转化技术研究的重点为如何建立和完善再生体系和提高基因转化频率，其中较为集中研究的方面有：①提高农杆菌侵染力。Dandekar等在苹果上研究发现，不同农杆菌株系致病能力差异很大。而农杆菌对寄主细胞的致病力主要受其携带的原质粒上的Vir区的6组基因（VirA、B、C、D、E、G）控制。筛选适宜的菌种对提高目标植物的转化成功率至关重要。研究者还发现，一些生理生化因素，如乙酸丁香酮（ace－tosyingone）、甜菜碱（betaine phosphate）、PH、温度、渗透压等通过调节Vir区基因来影响农杆菌致病力。②选择最佳受体材料。理想的受体材料其细胞既能与农杆菌直接接触，又能由单细胞分化再生植株。目前常用的外植体有叶片、茎段、原生质体、下胚轴、无性胚等，而以叶片应用最为广泛。③适宜的诱导和选择条件。筛选剂种类、筛选剂浓度、筛选时间、培养基基质等都会影响到转基因细胞的分化和再生植株。
2、生物弹射击基因转化
生物弹射击法（Biolistic System），又称“基因枪”法（Gene gun bombardment），也称粒子轰击法（Particle bombardment）或高速粒子微喷射技术（Hight velocityparticle microprojection），是一种机械转移基因的方法。采用加入Ca2+的亚精胺等使外源DNA吸附在钨金微粒表面，制成DNA—微弹，在基因枪激发的瞬间力量作用下，将外源基因直接导入植物细胞中。
生物弹射击法基因转化的最突出的优点是其应用的广泛性。这种方法将来可能成为一种“万能”基因转化法。它和农杆菌介导法不同之处在于它不只限于某些植物，而排斥另一些植物。在生物弹射击法发明（1987，Sanford）后的短短几年内，该法已成功地应用于高等植物（被子植物和裸子植物）、蓝藻、细菌、真菌、动物离体细胞和活体细胞组织。该法另一个优点是将外源DNA可以直接导入可再生的组织或细胞，因此不需要培养原生质体。
生物弹射击法已在多种植物上应用成功，经济林木上仅在番木瓜（Carica papaya）、蔓越桔（Veccinnim macrocarpa）上获得转基因植株。此外，Hebert等用包裹质粒的钨粒子轰击葡萄品种的细胞悬浮系，获得了转化的愈伤组织。Ye-XJ等以桃胚胎愈伤组织为受体进行粒子轰击，获得Gus（β-glucuronidase）基因表达。
生物弹射击基因转化由于受轰击速度、靶细胞距离、微弹直径、速度、射击的扩散半径、外源DNA的量及其结构等诸因素的影响，存在着价格昂贵、嵌合体不易排除、不易选择转化体、转化频率低等困难和问题使其在实践应用中受到一定的限制。
3、DNA直接摄取法
该法是将植物原生质体和外源DNA共同培养，通过一种化学或物理处理，使DNA直接进入植物细胞并得以转化和基因表达。常见的有聚乙二醇法（PEG法）、电场诱导法（electroperation）等。由于经济林木获得原生质体再生植株较为困难，而原生质体再生植株细胞变异频率极高因素的限制，目前此法在经济林上应用较少。
[资料来源：基因转化技术在经济林木遗传改良上的应用/刘占德(陕西省农科院信息所)//西北林学院学报.-1999,14(4).-115-120]
(2000-3-3-2-10)
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